Производственный процесс электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) в основном включает такие этапы, как приготовление геля, электрофорез, окрашивание и наблюдение за результатами.
Приготовление геля Приготовление разделительного геля (10%): смешайте 0 мл ddH₂O, 3 мл 30% исходного геля, 5 мл 5 моль/л трис-HCl, 1 мл 10% SDS и 1 мл 10% AP, добавьте 10 мкл TEMED, чтобы запечатать дно, а затем добавьте 4 мкл TEMED и хорошо перемешайте. Вылейте эту смесь между стеклянными пластинами, залейте сверху водой и подождите 30–60 минут, пока гель полностью полимеризуется.
Приготовление штабелирующего геля (4%): смешайте 4 мл ddH₂O, 33 мл 30% исходного геля, 25 мл 1 моль/л трис-HCl, 0,2 мл 10% SDS и 0,2 мл 10% AP, добавьте 2 мкл TEMED и немедленно хорошо перемешайте. Слейте воду с разделительного геля, добавьте эту смесь и сразу же вставьте гребенку между стеклянными пластинами, подождав 15-30 минут, чтобы укладочный гель полностью полимеризовался.
Операция электрофореза «Обработка образца»: смешайте образец с равным количеством загрузочного буфера 2XSDS, нагрейте при 100 градусах в течение 3 - 5 минут, а затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 1 минуты и возьмите супернатант для анализа SDS-PAGE.
«Загрузка»: возьмите 10 мкл индуцированных и неиндуцированных образцов и добавьте их в пул образцов, а также добавьте 20 мкл белковых стандартов с низкой молекулярной массой в качестве контроля.
«Электрофорез»: добавьте 1X буфер для электрофореза в резервуар для электрофореза, подключите источник питания, поддерживайте напряжение штабелирующего геля на уровне 60 В и напряжение разделительного геля на уровне 100 В. Когда бромфеноловый синий достигнет дна резервуара для электрофореза, прекратите электрофорез (около 3 часов).
Окрашивание и наблюдение за результатом
Окрашивание: Удалите гель со стеклянной пластины и окрасьте его красящим раствором Coomassie Brilliant Blue в течение 4–6 часов при комнатной температуре. Окрашивание: поместите окрашенный гель в раствор для обесцвечивания и обесцветьте его несколько раз, пока белковая полоса не станет четко видна. Наблюдение за результатами: После обесцвечивания гель можно сфотографировать и сохранить. После завершения этапа обесцвечивания поместите гель под систему обработки изображений для фотографии и сохраните результаты на дискету.